一、TUNEL細胞凋亡檢測具體步驟
以下步驟基于不同來源的參考信息綜合整理，具體步驟可能因試劑盒品牌或實驗條件的不同而有所差異：
樣本準備
組織樣本：將組織樣本進行脫蠟和水化處理，通常包括在二甲苯中浸泡，然后用梯度乙醇(100%、95%、90%、80%、70%)逐步脫水。
細胞樣本：對于貼壁細胞，先用PBS清洗，然后用4%多聚甲醛固定一定時間(如1小時)，再進行細胞通透處理(如使用Triton X-100)。
細胞通透
使用蛋白酶K(Proteinase K)處理樣本，通透細胞膜和核膜，確保TUNEL探針能夠進入細胞內。處理時間通常為15-30分鐘，具體取決于樣本類型和厚度。
TUNEL反應混合液制備
根據(jù)試劑盒說明書，制備TUNEL反應混合液。處理組通常包括TdT酶和熒光素標記的dUTP，而陰性對照組則不含TdT酶。
TUNEL反應
將TUNEL反應混合液滴加到樣本上，覆蓋蓋玻片或封口膜，在暗濕盒中避光孵育一定時間(如37℃下60分鐘)。
清洗與觀察
使用PBS充分清洗樣本，去除未結合的探針。
在熒光顯微鏡下觀察凋亡細胞，通常使用特定的激發(fā)波長(如450-500nm)和檢測波長(如515-565nm)。
（可選）酶聯(lián)顯色反應
對于某些試劑盒，還可以將熒光信號轉化為比色信號，以便在光學顯微鏡下觀察。這通常涉及使用POD轉換液和DAB底物進行顯色反應。
復染與封片
使用蘇木素或甲基綠對樣本進行復染，以襯托組織形態(tài)結構。
脫水、透明、封片后，在光學顯微鏡下觀察并拍照記錄結果。
二、檢定過程中需要注意的事項
樣本處理
確保樣本脫蠟和水化充分，避免影響后續(xù)步驟的結合反應。
細胞通透時間要適中，過長可能導致細胞破損，過短則可能影響探針進入細胞。
試劑配制與使用
TUNEL反應混合液應在使用前新鮮配制，避免長時間保存導致酶活性降低。
注意TdT酶對溫度的敏感性，儲存和使用時應避免反復凍融。
實驗條件控制
孵育溫度和時間應嚴格按照試劑盒說明書進行，避免影響反應效率。
實驗過程中應避光操作，以保護熒光探針不受光淬滅。
清洗步驟
PBS清洗步驟應充分，避免非特異性染色影響實驗結果。
清洗次數(shù)和時間可根據(jù)實際情況進行調整。
對照設置
必須設置陽性對照和陰性對照以驗證實驗結果的可靠性。陽性對照通常使用DNase I處理樣本以誘導DNA斷裂;陰性對照則不加TdT酶。
結果分析
觀察結果時應注意區(qū)分凋亡細胞與正常細胞以及非特異性染色。
可結合復染結果和顯微鏡下的形態(tài)學特征進行綜合分析。
TUNEL細胞凋亡檢測服務涉及多個精細步驟和注意事項。遵循正確的操作步驟和注意檢定過程中的細節(jié)問題對于獲得準確可靠的實驗結果至關重要。
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